A seguito dell’elezione della chiesa a Collegiata Insigne, avvenuta nel 1485, il capitolo dell’Assunta decise di dare nuovo vigore e ampliare lo spazio più importante della chiesa, il presbiterio. Grazie all’arciprete Nicolò Sapio si diede avvio ad un’importante opera di ampliamento della zona presbiteriale: all’originario corpo di fabbrica fu aggiunto un ampio vano che ancora oggi funge da presbiterio.

Il rinnovamento architettonico fu accompagnato da un rinnovamento importante delle suppellettili sacre e delle opere funzionali al culto.

Da segnalare la commissione a Napoli della pala d’altare, raffigurante l’Assunta, affidata a importanti artisti quali Leonardo Castellano e Leonardo da Pistoia, interpreti della maniera napoletana del terzo decennio del XVI secolo.

Allo stesso modo fu dato mandato a tre artisti meridionali, Candilora di Fanello, Teodoro da Marzano e Colantonio Bonafide che nel 1543 intagliarono un meraviglioso coro di legno di noce, ancora oggi perfettamente conservato.

In ultimo da segnalare, nella prima cappella sulla sinistra, la presenza di un presepe in pietra, realizzato nel 1587 sulla scorta del precedente presepe presente nella cattedrale di Matera e ascrivibile alla bottega dello scultore materano Altobello Persio.

Nel corso del XVI secolo la chiesa fu interessata da altri importanti lavori che modificarono l’assetto originario. Si realizzarono l’attuale rosone, i due leoni stilofori che sostituirono con ogni probabilità altri analoghi andati perduti e precedenti, si innalzò la seconda torre campanaria verso sud e in facciata furono murati tre stemmi araldici: quello di Carlo V d’Asburgo con ai lati gli altri del vicerè Pietro da Toledo e dell’arciprete del tempo, Vincenzo d’Avyla de Salazar.
Tra Seicento e Settecento, gli arcipreti della chiesa di Altamura si preoccuparono di rifinire la facciata, facendo edificare il terzo piano dei due campanili, crollati a seguito della caduta di alcuni fulmini e raccordarono le due torri con la costruzione di una loggetta in mazzaro su cui vennero collocate le statue della Vergine Assunta, al centro e, a un livello superiore, quelle dei santi Pietro e Paolo.